Der Sieg über den Perserkönig Darius III. bei Issus im Jahr 333 v. Chr. brachte Alexander den Großen der Herrschaft über das östliche Mittelmeer näher. Das Gemälde vermittelt eine Vorstellung von der Größe dieses Weltreichs. Altdorfer orientierte sich dabei am kartografischen Material seiner Zeit. Die später veränderte lateinische Inschriftentafel nennt Details und die Opfer der Schlacht. Die daran befestigte rote Kordel lenkt den Blick auf die Hauptperson. Das Bild ist Bestandteil des Historienzyklus, den Herzog Wilhelms IV. für die Münchener Residenz anfertigen ließ.